1. 서 론

Tetracycline (TC) 군의 항생제는 축산업에서 질병예방, 생산량 증대 및 성장 촉진을 목적으로 널리 사용되고 있다 (Blackwell et al. 2007). 가축에게 투여된 항생제는 몸 안에서 완전히 대사되지 않고 투여량의 10~90%가 모분자 (parent compound) 형태로 분뇨를 통하여 배출된다 (Halling-Sørensen 2000, Jjemba 2002, Kulshrestha et al. 2004). 가축분으로 배출된 항생제는 직접 또는 가축분 퇴비의 형태로 토양 환경에 유입되어 (Jechalke et al. 2014), 항생제 저항성을 가진 미생물을 증가시키거나 작물 생장에 부정적인 영향을 줄 수 있다 (Boonsaner and Hawker 2013). Song과 Guo (2014)는 항생제의 작물 축적에 따른 인체 전이 가능성을 보고하기도 하였다. 토양 내에서 TC는 양이온 교환, 전기적 이끌림, 표면 결합 등의 기작으로 토양 입자에 흡착된다 (Tolls 2001). 또한 TC는 다양한 작용기를 가지고 있어 환경 pH에 따라서 극성이 다른 다양한 화학종으로 존재할 수 있다 (Sarmah et al. 2006). 이러한 특징 때문에 pH는 토양 내에서 TC의 흡착량을 결정하는 중요한 인자다. 이 외에도 토양 양이온 교환능 (cation exchange capacity, CEC), 유기물 함량, 온도 등이 토양에 대한 TC 흡착량에 영향을 주는 것으로 알려져 있다 (Jones et al. 2005, Sassman and Le, 2005, Figueroa et al. 2010).

TC는 여러 개의 O- 와 N-작용기를 가지고 있으며 이들이 전자공여체 (electron donor)로 작용해 다양한 금속과 결합할 수 있다 (Albert and Rees 1956). 이와 관련한 선행 연구에서는 의약품으로서 혈액이나 체액에 존재하고 있는 마그네슘, 나트륨, 칼슘, 칼륨 등을 대상으로 약물동력학적으로 접근한 것이 주를 이루었다 (Bahrami et al. 2012). 반면 토양환경에서 TC는 앞서 언급된 양이온 뿐 아니라 중금속 양이온들과 함께 존재한다. 토양 내 다가양이온 중금속은 음전하를 띄고 있는 토양 표면과 TC의 음전하 부분 사이에서 다리역할을 하며 흡착을 돕는다. [토양–양이온–TC]의 3단 결합이 토양수 내의 양이온-TC 결합보다 안정할 경우 TC의 흡착량은 더 증가 된다 (Zhao et al. 2013). 토양 내 흡착량이 변화되면 TC의 환경 내 거동, 가용성, 분해 등도 변화하기 때문에 다가 중금속에 의한 다리역할은 TC의 식물에 대한 영향에 중요한 역할을 한다 (Carter et al. 2014).

이런 이유로 TC의 토양 내 거동에 영향을 미치는 중금속과 TC의 상호반응에 대한 보고가 있었다 (Thiele‐Bruhn 2003, Li et al. 2010, Zhao et al. 2011b). 토양 광물을 대상으로 금속이온의 존재가 TC 흡착량의 변화를 확인한 연구들이 여럿 있었으며, 특히 구리의 경우 TC의 흡착량이 증가하는 것으로 보고된 바 있다 (Wang et al. 2008, Zhao et al. 2011a). 하지만 이들 연구는 구리에 의한 TC 흡착량 변화를 수용액 상에서 확인한 것이며, 토양 내에서 확인한 연구는 희소하다.

본 연구의 목표는 (1) 토양 내에서 TC의 식물 독성을 확인하고, (2) 토양 중에서의 구리에 의한 TC의 흡착량 변화가 식물독성에 미치는 영향을 확인하는 데에 있다.

2. 재료 및 방법

2.1 대상 토양의 선정과 처리

본 실험에 사용된 토양은 충청북도 단양군 적성면 하원곡리에서 채취하였다. 채취한 토양은 풍건한 후 2 mm 체로 걸러서 실험에 사용하였다. 채취된 토양은 TC 와 Cu 그리고 두 물질을 혼합한 처리구로 나누었다. TC 처리구는 Tetracycline (Sigma-Aldrich)을 100 g의 토양에 각각 0, 10, 50, 100, 300, 500, 750 mg kg^-1 의 수준으로 5 mL의 증류수에 녹여 첨가한 후 20 분간 혼합하여 스파이킹하였다 (Boxall et al. 2006, Liu et al. 2009).

토양의 구리는 CuSO₄의 상태로 처리하였으며 농도는 각각 0, 2.5, 7.5, 17.5 mg kg^-1 (Cu-0, Cu-1, Cu-2, Cu-3)의 수준으로 처리되었다. 토양에 대한 구리의 처리는 Daoust et al. (2006)의 방법을 일부 수정하여 진행하였다. 2 mm로 채친 토양 200 g을 CuSO₄용액에 1:1.5의 비율 (w/v)로 500 mL Nalgene bottle에 넣고 24시간 동안 교반기를 이용하여 교반하였다. 후에 72 시간 동안 구리 흡착이 일어날 수 있도록 정치시켜놓았다. 구리 첨가 과정 끝에 토양 용액은 원심분리기 (Avanti J-E, Beckman, CA, USA)를 이용하여 30 분간 5000×g의 조건에서 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 토양 pH는 이후에 다시 조정해주었다. 남은 토양 혼합물은 오븐에서 60°C로 건조시켜 분쇄한 후 폴리비닐 팩에 보관하였다. 또한 앞서 제조한 구리 처리 토양을 일부 분리한 후 상추에 유의한 독성을 나타낸 농도인 750 mg kg^-1의 TC를 처리하여 구리와 TC의 혼합 처리 토양 (TCu-0, TCu-1, TCu-2, TCu-3)을 제조하였다.

토양의 토성, pH, 유기물 함량, 중금속 함량, CEC 등은 농업과학기술원 토양 및 식물체 분석법 (NIAST 2000)에 의거 분석하였으며 토양의 식물 가용성 중금속은 Mehlich-III 분석법을 이용하였다 (Mehlich 1984).

2.2 식물의 재배

㈜다농에서 구입한 적치마상추 (Lactuca sativa L.)를 실험을 수행하였다. 각각의 처리된 토양을 petri dish (60 × 15 mm)에 35 g 씩 준비한 후, pre-germinated 된 상추 종자를 5 mm 깊이로 10개씩 심었다. 그 후 petri dish를 growth chamber로 옮긴 후, water holding capacity의 약 50% 수준으로 수분과 주간 16 시간 / 야간 8 시간의 광주기 조건에서 실시되었으며 온도는 21±2°C 조건으로 유지시켜 주었다. 각 처리구는 3반복하였으며 TC의 예비 독성 실험은 1주 그 외는 3주 뒤에 수확하였다.

2.3 식물의 분석

재배가 종료된 식물은 수확 한 후에 바로 뿌리에 붙은 토양 입자를 씻어내기 위하여 수돗물로 충분히 행구고 마지막으로 증류수로 세척하였다. 세척이 완료된 식물체는 Epson Perfection V700 (Epson, Nagano, Japan)를 통하여 스캔하고 이를 이미지 분석 프로그램 (WinRhizo 5.0a, Regent, Canada)을 통하여 작물의 길이 (지상부+지하부)를 측정하였다. 측정된 길이 비교를 통하여 처리구간 독성을 비교, 평가하였다. 이미지 분석 후 식물체의 생중량을 측정하였다 (Koo et al. 2013).

3. 결과 및 고찰

3.1 토양의 특성

실험에 사용한 토양의 주요 특성을 Table 1에 정리하였다. 유기물 함량은 0.76%이며 토성은 양질세사토 (lomy fine)로 pH는 7.7이었다. 실험에 이용된 토양은 평균적인 농경지 토양에 비하여 유기물 함량이 적다. 다른 유기화합물과 마찬가지로 TC 역시 토양 내 유기물에 많이 흡착된다고 알려져 있다 (Jechalke et al. 2014). 이 때문에 본 실험에 사용된 토양은 평균적인 다른 토양에 비하여 유기물 영향이 적을 것으로 판단되었다.

Table 2에 나타나는 왕수분해법에 따른 토양의 구리 농도에서는 Cu-0과 Cu-1간의 구리 농도에 유의한 차이가 없었고, Cu-2, Cu-3의 순서대로 유의하게 상승하였다. 이외의 독성을 발현할 수 있는 미량 원소는 납이 Cu-1과 Cu-2에서 농도가 소폭 감소한 것을 제외하고는 관찰되지 않았다. Table 3에 나타난 Mehlich-3 법에 의해서 침출된 유효태 미량원소의 경우에는 왕수 분해법과 다르게 Cu-1에서부터 Cu-0와 비교하여 유의한 구리 농도의 상승을 확인하였으며 Cu-1, Cu-2, Cu-3의 순서로 지속적으로 유의하게 상승하였다. 다른 미량 원소들의 농도는 유의하게 변화하지 않았다. 따라서 본 실험의 구리 처리는 실험 결과에 유의한 영향을 줄 것으로 판단된다.

Table 1. Major properties of soil used in this study.

Table 2. Total heavy metal concentration of soil after Cu treatment (mean±SD). The letters after numbers indicate significant difference among the treatments at P<0.05 by ANOVA and Tukey test.

1Not detected.

Table 3. Heavy metal availability of soil after Cu treatment (extracted by Mehlich – III method) (mean±SD). The letters after numbers indicate significant difference among the treatments at P<0.05 by ANOVA and Tukey test.

1Not detected.

3.2 상추에 대한 tetracycline의 독성 실험

TC 독성 범위를 알기 위한 1주일간의 노출 실험에서 실험 농도 범위에서 500 mg kg^-1까지 통계적으로 유의한 차이가 나타나지 않았고, 750 mg kg^-1에서 다른 처리구에 비하여 현저하게 생장이 저하되었다 (P < 0.05) (Fig. 1). 로지스틱 모델식 (logistic model)을 통하여 TC 노출 시 대조구 대비 50%의 생장 저해를 일으키는 농도인 EC50과 10%의 생장 저해를 일으키는 농도인 EC10을 계산하였다. 실험 농도 범위에서는 EC50이 나타나지 않았으며 (>750 mg kg^-1), EC10은 726.83 mg kg^-1으로 나타났다. 이후 TC가 처리되지 않은 대조구 (TC-0)와 750 mg kg^-1 의 TC가 처리된 처리구 (TC-750)에서 3주간 상추를 재배한 결과에서 역시 생장량에 유의한 차이를 확인하였다 (Fig. 2). TC가 처리되지 않은 대조군 과 750 mg kg^-1가 처리된 처리구의 평균 고사율 (mortality rate, 고사한 개체수 / 파종한 개체수 × 100), 생중량 (총 무게 / 발아한 개체 수)은 유의한 차이를 보이지 않았다 (Table 4).

Fig. 1.

Elongation of lettuce with exposure to different concentration of tetracycline on soil. Error bar indicates standard deviation.

Fig. 2.

Length per seedling with different concentration of copper in soil. Copper concentrations in Cu-0, Cu-1, Cu-2, Cu-3 are 5.02, 7.63, 14.10 and 25.05 mg kg^-1, respectively. Error bar indicates standard deviation. Means with different letters indicate significant difference at P＜0.05 by ANOVA and Tukey test.

본 연구 결과에서는 TC에 의한 상추의 생장의 저해를 확인할 수 있었다. TC에 의한 식물의 생장 저해는 기존의 연구에서도 다양한 조건에서 확인되었다. Hillis et al. (2014)의 연구에서는 알파파, 당근, 상추 등에서 TC에 의한 독성을 확인하였고, Pomati et al. (2004)의 연구에서는 좀개구리밥을 대상으로 고농도의 TC가 생장에 저해를 일으킴을 확인하였다. 또한 Hillis et al. (2014)의 연구에서 상추의 EC10과 EC50의 값은 각각 1.815, >10 mg L^-1으로 본 연구 결과에서 나타나는 EC10 값인 726.83 mg kg^-1에 비하여 480배 가량 낮았다. 이를 통하여 TC가 수경 재배를 통하여 노출되었을 때에 비하여 토양을 통하여 노출되었을 때 더 낮은 독성을 나타낸다는 사실을 확인할 수 있었다.

Table 4. Mortality rate, fresh weight per seedling after tetracycline (TC) treatment. Control and TC-750 are treatments with tetracycline 0 and 750 mg kg-1, respectively. The letters after numbers indicated significant difference among the treatments at P<0.05 by ANOVA and Tukey test.

3.3 구리 함량에 따른 상추의 성장 비교

구리 단독 처리를 한 Cu-0, Cu-1, Cu-2, Cu-3 처리구에서 자란 상추의 길이는 각각 64.02, 71.87, 61.60 및 50.69 mm로 처리한 구리 함량에 따라서 식물체의 성장 정도가 다르게 나타났다 (Fig. 3). Cu-0 비교하여 Cu-1 과 Cu-2에서의 상추의 길이는 유의한 차이를 나타내지 않았지만, Cu-3에서는 유의하게 감소하였다. Cu-3는 Cu-0와 비교하여 생장 저해가 나타난 것을 확인할 수 있었다. 상추의 생중량은 Cu-1에서는 유의한 차이가 나지 않고 Cu-2, Cu-3에서 생중량의 감소가 확인되었지만, 평균 고사율은 Cu-0과 비교하여 Cu-1, Cu-2, Cu-3의 모든 처리구에서 고사율이 유의 상승하였음을 확인하였다 (Table 5).

Fig. 3.

Length of seedling on control and TC-750. Control and TC-750 are treatments with tetracylcine 0 and 750 mg kg^-1, respectively. Error bar indicates standard deviation.

본 실험 결과에서 Cu-1과 Cu-2에서 상추의 구리 흡수는 영양분으로 활용 가능한 수준으로 독성이 나타나지 않았지만, Cu-3에서의 구리 흡수량은 영양분으로의 활용 범위를 넘어서 독성이 발현 된 것으로 판단된다. 구리는 식물의 필수원소로 알려져 있으며 미량 필수원소로 분류 되어있다. 토양수 내에서 구리의 농도가 0.1 mg kg^-1 미만일 때는 결핍 증상으로 인하여 식물 생육이 불가능하다고 알려져 있다 (Mocquot et al. 1996). 구리가 부족한 농업용 토양에서는 추가로 시비하여 생산량을 유지시키기도 한다 (Baker and Walker 1989). 반면 토양 중에 구리의 함량이 지나치게 높을 경우에는 광합성 기작과 효소 생산에 영향을 주어 생장을 억제하여 식물에 피해를 주기도 한다.

Fig. 4.

Length per seedling with different treatment soil. Error bar indicates standard deviation. Means with different letters indicate significant difference at P＜0.05 by ANOVA and Tukey test.

Table 5. Mortality rate and fresh weight per seedling of lettuce on Cu treatments. The letters after numbers indicated significant difference among the treatments at P < 0.05 by ANOVA and Tukey test.

3.4 상추에 대한 tetracycline의 성장 저해에 미치는 토양 구리의 영향       

상추에 대하여 TC가 미치는 생장 저해에 토양 구리가 미치는 영향을 확인하기 위하여, TC가 동일하게 750 mg kg^-1으로 처리되었지만 토양 내 구리 함량이 다른 각각의 처리구 TCu-0, TCu-1, TCu-2, TCu-3에서 3주간 상추를 재배하였고 그 결과, TCu-0에 비하여 구리함량이 높은 세 가지 처리구 TCu-1, TCu-2, TCu-3 모두에서 상추의 생장이 유의하게 증가하였지만 세 처리구 간에는 유의한 차이가 존재하지 않았다 (Fig. 3). 각 처리구별로 고사율은 각각 14, 16, 20 및 8%로 통계적으로 유의한 차이가 나지 않고 모두 같은 수준으로 나타났다. 생중량은 TCu-1는 TCu-0과 유의한 차이를 나타내지 않았고, TCu-2와 TCu-3는 TCu-1에 비하여 유의하게 감소하였다 (Table 6).

대표적인 2:1 토양 점토 광물인 montmorillonite에 대하여 구리와 TC의 흡착에서 상호작용을 연구한 결과에 따르면 구리가 없는 수용액보다 구리가 같이 존재하고 있을 때 TC의 흡착이 증가하는 것을 확인하였다. TC와 구리의 결합체가 TC이온 홀로 있는 것보다 montmorillonite 대하여 흡착계수가 높았다 (Wang et al. 2008). 대표적 1:1 광물인 kaolinite는 montmorillonite와 비교하여 적은 음전하와 CEC를 가지며 내부층위를 가지고 있지 않기 때문에 표면적이 적음에도 kaolinite를 대상으로 한 연구에서 구리가 존재할 시 흡착이 크게 증가한다고 보고하였다 (Zhao et al. 2011b). 이는 구리이온이 kaolinite의 표면에 내부 계면 결합 (inner- sphere complex)를 통하여 구리가 표면에 단단히 결합하여 TC의 여러 화학종들과 kaolinite 사이에서 구리이온이 다리역할을 하기 때문이라고 설명하였다 (Zhao et al. 2011b).

본 연구 결과에서 구리의 처리에 의해서 TC가 처리된 토양에서 자란 상추의 생장 저해가 감소하는 것을 확인하였다. 기존의 연구 결과와 마찬가지로 토양 내 구리에 의한 TC의 흡착으로 인하여 상추가 흡수한 TC가 감소한 결과로 보인다. 또한 TCu-2와 TCu-3의 생중량이 감소한 것은 과량의 구리로 인해 독성이 발현된 것으로 판단된다.

Table 6. Mortality rate and fresh weight per seedling of lettuce on TCu treatments. The letters after numbers indicated significant difference among the treatments at P < 0.05 by ANOVA and Tukey test.

4. 결 론

실험 토양에서 상추에 대한 TC의 식물 독성 실험 결과, 750 mg kg^-1 수준에서 대조구와 유의한 차이가 나타났다. 이전 연구들과 마찬가지로 TC에 의하여 상추의 전체 길이가 짧아졌지만 이는 수용액에서 상추 독성이 발현되는 농도와 비교하여 400배 가까이 높은 값을 보여 수용액에서와 토양에서의 독성 발현이 달라짐을 확인할 수 있었다. 구리 처리에 따른 상추의 생장을 살펴보면, 대조구인 Cu-0와 비교하여 구리가 추가된 Cu-1, Cu-2, Cu-3의 상추에서 생장이 증가하는 것을 확인하였으며, Cu-1의 경우에서 길이가 가장 크게 나타났고 구리 함량이 증가한 Cu-2와 Cu-3에서는 감소하였다. 이는 구리가 미량 필수 원소로 적정량은 생장에 도움이 되지만 다량의 구리는 오히려 독성을 나타낸 것을 의미한다.

마지막으로 구리의 처리 농도가 TC의 상추 생장저해에 미치는 영향을 확인한 결과 같은 TC가 처리되었음에도 구리가 추가된 처리구에서는 피해폭이 감소하였다. 이는 구리 처리가 TC의 토양 표면 결합과 흡착이 증가하여 생물 유효도가 감소하였기 때문에 상추에 대한 악형향이 감소한 것으로 판단되며, 구리함량이 많아지는 경우에는 그 독성 저감 효과가 떨어지는데 이는 높은 구리 농도로 인한 독성인 것으로 판단된다. 이러한 토양 실험에서의 결과는 TC의 효과 농도가 높아지는 점 이외에는 수용액 상의 연구 결과와 유사한 패턴을 나타냈다.

종합해보면 TC로 오염된 농경지나 토양에 적정량의 구리 처리는 식물 생장 감소 방지에 도움이 될 것으로 보인다. 그러나 과량의 구리 처리는 독성으로 작용 할 수 있으므로 적절한 처리량에 관한 후속연구가 필요해 보인다. 더하여 TC 오염 영향을 평가함에 있어 절대적인 농도뿐 아니라 토양의 특성과 양이온의 함량 등을 종합적으로 고려해야 할 것이다.